Джейкоб Ли оказывается в тюрьме на Каллисто — спутнике Юпитера. Став жертвой обстоятельств, он должен выжить среди монстров и пришельцев, а также противостоять заключённым, которых загадочные мутации превращают в чудовищ. Разбираясь с опасностями, герой постепенно раскрывает тайны, связанные с Юпитером.

The Callisto Protocol — хоррор от третьего лица с мрачной, гнетущей атмосферой и научно-фантастическим окружением. В одиночной кампании игрок следует за сюжетом, смотрит кат-сцены и принимает решения от лица Джейкоба. Чтобы справляться с противниками, можно вступать с ними в бой, пользоваться оружием и интерактивными предметами, скрываться или обходить скопления монстров.

Продвижение требует планировать маршрут, решать головоломки и взаимодействовать с предметами, нужными для заданий. Для атак на расстоянии Джейкоб применяет особую гравитационную пушку: она позволяет метать в противников найденные предметы интерьера. Чтобы попасть в новые локации, нужно открывать проходы и разгадывать загадки, используя спрятанные записи с подсказками.