Desperados 3 рассказывает о знакомстве Джона Купера с будущими товарищами ещё до событий первой игры. Вместе с ним действуют Док Маккой, Кейт О’Хара, Гектор и Изабель. Их путешествие проходит через небольшие города, ранчо, лагеря, пустынные участки, болота и железные дороги Дикого Запада.

Изометрическая камера позволяет наблюдать за группой и окружением. Задания допускают несколько подходов: открытые столкновения, скрытные действия и попытки обойтись без лишнего кровопролития. Выбор зависит от возможностей персонажей и расположения противников.

Каждый участник отряда обладает своими инструментами. Купер отвлекает внимание монетой, другие герои используют ловушки и особые приёмы. Изабель способна влиять на врагов магией вуду и связывать их состояния, создавая необычные сочетания действий.

Режим планирования «Побоище» помогает согласовывать индивидуальные команды бойцов. Разные типы охраны и сильные противники требуют учитывать особенности всей группы, а не полагаться только на одного героя.