Эцио Аудиторе продолжает борьбу с тамплиерами в Риме Assassin’s Creed Brotherhood. Влияние Борджиа определяет жизнь города, а укрепление братства становится частью противостояния. Современная линия Дезмонда связана с переживанием воспоминаний его предка через Анимус.

Открытый город исследуется от третьего лица: перемещение по зданиям, скрытность и бой позволяют выбирать подход к заданиям. Орлиное зрение выделяет врагов, союзников, важные объекты и цели разными цветами. Поведение противников и их специализации требуют учитывать особенности каждой схватки.

При поддержке Макиавелли Эцио берёт на себя руководство орденом. Горожан можно привлекать в братство и призывать на помощь; развитие сети ассасинов дополняет личные действия героя. История продолжает итальянскую часть серии и конфликт вокруг власти Борджиа и Яблока Эдема.