Италия эпохи Возрождения становится местом истории Эцио Аудиторе — молодого дворянина, который после семейной трагедии вступает в борьбу с заговорщиками. В Assassin’s Creed 2 Deluxe Edition личная месть постепенно связывается с противостоянием ассасинов и тамплиеров. Путешествие ведёт через Флоренцию и Венецию; среди знакомых героя оказываются влиятельные современники, включая Леонардо да Винчи. Историческую линию объединяет с современностью история Дезмонда Майлза.

Городские улицы и крыши дают несколько способов добраться до цели. Можно двигаться над толпой, искать укрытия или переходить к открытому столкновению. Боевая система позволяет отобрать у противника оружие, а расширенный набор приёмов меняет ход поединков. Эцио умеет плавать: вода тоже помогает перемещаться и ненадолго скрываться от преследования.

Разобраться в окружении помогает орлиное зрение, выделяющее важные фигуры и объекты. Помимо основной истории, в открытых городских районах доступны дополнительные поручения. Они дают повод исследовать мир и освоить возможности персонажа, а не двигаться только от одного сюжетного эпизода к следующему. По мере прохождения герой приобретает новые навыки и инструменты, превращаясь из неопытного мстителя в подготовленного ассасина.