В Wolfenstein 3D игрок выступает американским разведчиком Уильямом Бласковицем, который противостоит нацистским солдатам. В поисках планов операции «Железный кулак» он попал в плен, но затем сумел бежать и намерен продолжить задание. Путь героя пролегает через череду локаций с нацистскими постройками, бункерами и укреплениями. Среди противников встречаются монстры, сторожевые псы и солдаты. У каждого врага свои показатели здоровья и оружие; после его гибели выпадает определённый предмет.

Игра состоит из шести эпизодов, посвящённых разным этапам пребывания Уильяма во вражеском окружении. В финале каждой главы его ждёт сильный босс. Победив главного врага, игрок получает текст о последствиях этой битвы и новых задачах Бласковица. На уровнях можно находить боеприпасы и аптечки, восстанавливающие здоровье.

Запас жизней ограничен и имеет большое значение: если потерять их все, главу придётся проходить заново, начав лишь с пистолетом и ножом. За уничтожение врагов и выполнение заданий начисляются очки. Их можно заработать, однако несколько смертей подряд обнулят результат.