Repentance опирается на оригинальную The Binding of Isaac и все её дополнения. В расширенной игре появились новые места, герои, противники, боссы и предметы. История по-прежнему отсылает к библейскому преданию об Аврааме и Исааке. Графику, визуальную подачу и движок немного изменили; по описанию, это сделало игровой процесс более плавным и приятным.

Здесь доступны четыре персонажа: Азазель, Эдем, Лазарь и Потерянный. Азазель начинает с маленькой серой, а Эдему при старте могут случайным образом достаться разные характеристики. У Лазаря две жизни; Потерянный же становится доступен после выполнения определённых условий. Параметры части героев сохранились, тогда как других существенно перебалансировали.

В описании Rebirth заявлены 500 часов игрового процесса, 20 соревнований, более 450 предметов, включая 160 скрытых, и свыше 100 персонажей. Также добавлены 25 врагов и 16 боссов. Предусмотрены несколько ячеек сохранения и кооператив для двух игроков. Среди новых артефактов названы Лёгкое Монстро, Слив, чёрные и красные свечи и другие предметы.

В The Binding of Isaac: Rebirth есть тайный босс Молчание. Доступ к нему открывается лишь при условии, что финальный босс на уровне Мамино Сердце будет побеждён менее чем за 30 минут. Переход на новый движок привёл к тому, что часть механик удалили, а часть заменили.

Изменения игрового процесса и интерфейса включают возможность сохранения и выбор из двух режимов сложности — нормального и сложного. Управление мышью убрали, добавив поддержку геймпадов. Полоска здоровья задаёт предел числу сердец душ, а количество спутников может достигать шести. Быстрое прохождение открывает Комнату вызова; для доступа в Комнату Ангела требуется набрать определённое количество веры.