Действие разворачивается в Нью-Йорке, где мутанты и люди привыкли жить рядом. Мирное сосуществование оказывается под угрозой: по городу разбросаны загадочные ёмкости с солью, а вслед за ними на улицы выходит целая армия новых мутантов. Лео, Раф, Майки и Донни оказываются в центре этого кризиса.

У каждой черепашки свой боевой почерк: Лео полагается на лидерские качества, а Майки — на непредсказуемый стиль. Играть можно одному или вместе с тремя друзьями. Вместе вы будете патрулировать город, изучать очаги заражения и разыскивать мутантов. Для передвижения по Нью-Йорку пригодятся паркур по крышам и спуски в канализацию; в сражениях предстоит отражать атаки противников-ниндзя.

В поисках мутантов и попытках сохранить порядок черепашки встречают Эйприл О'Нил и Мастера Сплинтера: знакомые персонажи делятся сведениями и дают задания. Бои здесь сочетаются с исследованием и детективными эпизодами — одной сноровки с нунчаками недостаточно, порой нужно и как следует подумать.