В Skullgirls 2nd Encore можно сражаться один на один или командами. В бой допускается взять до трех героев, а выбор единственного бойца увеличивает его запас здоровья. Игрок в любой момент призывает персонажа на подмогу и может настроить его вспомогательные атаки. Комбо и суперудары становятся доступны при заполнении энергетической шкалы; брейкеры прерывают атаки, но некоторые удары нельзя заблокировать. Модификаторы позволяют сделать бои легче или сложнее.

Игра предлагает одиночную кампанию, аркадный режим, тренировки и дуэли с другом. В основе боевой механики — идеи серии Marvel vs. Capcom. В тренировочном режиме можно изучить каждого бойца.

В списке персонажей — восемь героев: Филия, Церебелла, Пикок, Парасоул, Мисс Форчун, Пэйнвил, Валентайн и Дабл. По мере игры открываются еще пять протагонистов: Сквигли, Биг Бэнд, Элайза, Беовульф и Робо-Форчун. У каждого героя собственные облик, стиль боя и суперудары.

События сюжета происходят в королевстве Кэнопи. Таинственная организация разыскивает мистический артефакт Сердце-Череп, способный раз в семь лет исполнить желание женщины. Артефакт подчиняется только обладателям черной души. Со временем череп полностью захватывает разум своей владелицы и превращает ее в Скалгерл.